MATERI BAHAN GENETIK

  BAHAN GENETIK

A.      Bahan Genetik

Pengetahuan tentang pengaturan asam deoksiribonukleat (ADN) didalam kromosom dapat membantu kita untuk mengerti bagaimana gen dan mengatur sintesis protein. Juga akan memperjelas perubahan komposisi gen karena mutasi. ADN mengandung informasi genetik dalam bentuk kode. Kode ini telah di terjemahkan dalam suatu model yang menggamabarkan bagai mana informasi tersebut berlangsung dari ADN dalam gen sampai pada protein dalam sel hidup.

Gen sesuai dengan daerah dalam DNA, molekul terdiri dari rantai empat jenis nukleotida-urutan nukleotida ini adalah informasi genetik organisme mewarisi. DNA alami terjadi dalam bentuk yang terdampar ganda, dengan nukleotida pada setiap untai komplementer satu sama lain. Setiap untai dapat bertindak sebagai template untuk membuat sebuah mitra baru untai-ini adalah metode fisik untuk membuat salinan dari gen yang dapat diwariskan.

Urutan nukleotida dalam gen diterjemahkan oleh sel untuk menghasilkan rantai asam amino, menciptakan protein-urutan asam amino dalam protein sesuai dengan urutan nukleotida dalam gen. Hubungan antara urutan nukleotida dan urutan asam amino yang dikenal sebagai kode genetik. Asam amino dalam protein menentukan bagaimana lipatan menjadi bentuk tiga-dimensi struktur ini, pada gilirannya, yang bertanggung jawab untuk fungsi protein tersebut.

Protein melaksanakan hampir semua fungsi yang diperlukan untuk sel untuk hidup. Sebuah perubahan DNA pada gen yang dapat mengubah asam amino protein, mengubah bentuk dan fungsi: ini dapat memiliki efek dramatis dalam sel dan pada organisme secara keseluruhan. Meskipun genetika memainkan peran besar dalam tampilan dan perilaku organisme, itu adalah kombinasi dari genetika dengan apa sebuah pengalaman organisme yang menentukan hasil akhir. Sebagai contoh, sementara gen memainkan peran dalam menentukan ukuran suatu organisme, nutrisi dan kondisi lain pengalaman setelah awal juga memiliki efek yang besar.

1.    Perbedaan Antara ADN, ARN, Kromosom, DNA dan Sel

ADN (asam deoksiribonukleat) adalah bahan yang diwariskan dan merupakan unsur pokok kromosom yang disebut nuklein atau bahan yang ada hubungannya dengan nukleus. Miescher seorang ahli Fisika dari swiss, dalam tahun 1871 melihat adanya endapan dari inti nanah karena mudah didapat pada  kain pembalut luka dan mengandung sel darah putih (sel yang paling sederhana) kemudian ia mengunakan sperma ikan salmon yang hanya terdiri dari nukleus dan sedikit sitoplasma. Juga ikan salmon ini terdapat di dalam sungai Rhine yang letaknya dekat. Hasil analisis kimia menunjukkan bahwa endapan tersebut terdiri dari fosfor dan nitrogen. Sebenarnya Miescher telah menemukan gugus ADN protein tetapi tidak mengetahuinya.

Beberapa tahun kemudian E.B. Wilson menyatakan bahwa asam nuekleat adalah bahan kuturunan, tetapi bukti-bukti belum ada selama setengah abad. Hertwig dalam tahun 1884 menyatakan bahwa nuklein ada hubungannya dengan pembuahan dan pewarisan sifat-sifat keturunan.

a.    ADN dan Kromosom

ADN terdapat hampir seluruhnya dalam kromosom organisme tingkat tinggi. ADN dalam sel diploid untuk semua organisme pada dasarnya sama dan jumlahnya berubah-ubah dengan adanya replikasi kromosom. Jumlah dan jenis protein di dalam sel diploid dan sel haploud berubah-ubah tidak tergantung pada jumlah kromosom.

1.    Reaksi pewarna Feulgen (dikembangkan sekitar tahun 1920)

Zat pewarna ini khususnya untuk ADN dan kromosomsangat mudah menyerap. Jumlah noda bewarna dapat di ukur dengan fotometer (jumlah sinar yang diserap apabila sel yang telah dicat diletakkan pada mikroskop dan sinarnya di arahkan pada sutu initi tunggal). Inti-inti dari gamet menyerap sinar sebanyak ½ dari jumlah sinar yang di serap oleh sel somatik.

2.    Sinar Ultra Violet dan ADN

Ultra violet dapat menyebabkan mutasi pada kekuatan 2600 A⁰.  Ini sesuai dengan penyerapan maksimum ultra violet oleh ADN. Sebaliknya protein hanya menyerap sedikit pada 2600 A⁰. 

3.    Transformasi Bakteri dan ADN dalam Kromosom Tikus

Dalam tahun 1928 Griffith melkukan percobaan dengan memakai dua galur (strain) Diplococcus pneumoniae yang menjangkiti tikus. Salah satu tipe disebut tipe kasar (R = Avirulen) bila disuntikan pada tikus menyebabkan tikus sakit tetapi tidak mati. Tipe lain yang disebut dengan tipe halus (S = Virulen) menyebabkan septisema dan kematian pada tikus. Apabila galur S dapat di isolasi. Perlu bahan tipe ini disebut transformasi karena ada pertukaran ADN.

4.    Aktifitas ADN dalam Virus

Hershey dan chase melakukan percobaan dengan bakteriphage dan bakteria (E.  Coli) dalam tahun 1952. Mereka berpendapat bahwa ADN adalah substansi gen yang aktif bukan kumpulan pecahan protein gen seperti yang telah dinytakan sebelumnya. Percobaan klasic ini diuraikan jelas dalam pustaka dan saudara supaya membaca dan mengerti maksudnya.

b.   ARN sebagai Bahan Keturunan

Asam ribo nokleat adalah satu perkecualian bahwa ADN adalah satu-satunya bahan keturunan. Pada beberapa virus, ARN mengantikan ADN sebagai bahan genetik .

c.    ARN (Asam Ribo Nukleat)

Dua tipe asam nuklet telah diketemukan setelah di ketahui bahwa asam ini merupakan dasar dari bahn keturunan. ADN terdapat hampir seluruhnya dalam inti dan ARN terdapat dalam inti dan sitoplasma.

ARN biasanya terdiri dari satu pita (strand) sedang ADN terdiri dari pita rangkap. ARN mengandung ribosa dan ADN mengndung deoksiribosa. Pada kedudukan C yan kedua, deoksi ribosa kekurangan satu oksigen. ARN mengandung pirimidin Urasil (U) bukan timin. Molekul ARN biasanya lebih pendek dari pada molekul ADN. Fungsi ARN terutama dalam sintesis protein dan ada tiga tipe ARN.

d.   Struktur Fisik dari ADN

Bentuk spiral ganda (double helix) menurut Watson-crick diumumkan pada tahn 1953.

1.    Mereka mengusulkan bentuk spiral ganda yang terikat menjadi satu olah ikat hidrogen antara basa yang berpasangan sebagai A-T dan G-S

2.    Pola difraksi ADN oleh sina X. Wilkins dan franklin pada tahun 1950 melaporkan bahwa bagian ADN ( nukleutida) tesusun dengan konfigurasi tepat dan dengan interval tetap dalam molekul itu.

3.    Pauling menduga bahwa molekul terdiri dari tiga pita dengan ikatan gula-fosfat ditengah,tetapi disanggah oleh watson dan crick.

4.    Model watson dan crick menggunakan informasi dari peneliti lain yaitu perbandingan 1.1 antara A=T, G=S, dari Chargaff, model tiga pita dari pauling dan di fraksi sinar X dari wilkins dan franklin.

5.    Kita sekarang tau bahwa ADN terdiri dari pita polinukleotida yang panjang dan saling membelit sehingga membentuk spiral ganda (double ganda).

e.    Replikasi ADN

Watson dan Crick mengusulkan bahwa replikasi terjadi karena putusnya ikatan hidrogen yang menghubungkan pasangan-pasngan basa dengan terlepasnya kedua Pita ADN dan terbentuk pita komplemennya.

f.     Metode Replikasi

1.    Replikasi semi konservatif – terjadi pemisahan spiral ganda (duplex) menjadi dua pita pada daerah tertentu dengan jarak yang pendek. Akibatnya kedua pita mempunyai nukleotida yang tidak berpasangan. Nukleotida yang terdapat pada sel akan tetarik pada basa yang sesuai dalam molekul ADN.

2.    Replikasi konservasif – pasangan pita lama tetap tak berubah dan terbentuk molekul ADN yang terdiri dari dua pita baru. Molekul anak tidak mengandung bagian dari molekul ADN asli.

3.    Replikasi disfersif – pasangan pita lama terputus menjadi beberapa bagian, krudian mengganda dan pada generasi berikutnya ADN akan terdiri dari bagian lama dan baru yang letaknya terseber pada pita ADN.

g.    Bukti Adanya Replicasi Semi Konservatif

Autoradiogram dari kromosom Vicia faba digunakan untuk memasikan tipe replicasi ADN. Timidin radioaktif dimasukkan di dalam ADN selam repliskaikromosomdengan jalan menumbuhkan akar vicia dalam larutan ³H timidin (⁰H adalah H yang bert disebut trimidin) dan sel dibiarkan mengalami replikasi satu kali, sel dimbil, dicuci dan kemudian ditutup denganfilm.

Bila atom radiaktif rusak dan menimbulkan titik hitam pada film, berarti satu  kromosom mempunyai label timidin radiaktif sedang yang lain tidak, yang menunjukkan adanya replikasi konservatif. Tetapi semua kromosom dengan label timidin akan menunjukkan adanya replikasi semi  konservatif atau disfersif. Dengan membiarkn sel membelah satu kali pada timin yang diberi label, keudian dicuci diikuti dengan satu kali pembelahan sel dalam timidin tanpalabel maka akan terdapat kromosom dengan lalbel dan tanpa label, yang terlihat pada foto.dalam kenyataanya terlihat demikian dan ini membuktikan adanya replikasi semi konservatif.

Meselson dan stahl menggunakan teknik sentrifuge pada tahun 1958 untuk menentukan metode replicasi ADN. Teknik ini berdasrkan  pengetahuan bahwa larutanseperti ADN apabila diputar dalam larutan yang sesuai misalnya cesium chlorida (CsCl) akan memisah pada tingkat kepekatan tertentu. Mereka menumbuhkan escerichia coli pada mediun N¹⁵ (nitrogen yang diberi label) sampai ADN menjadi berat.

h.   Biosintesis ADN

Pada pita ADN, gugus fosfat melekat pada posisi 5’dari satu gugus gula dan pada posisi 3’ dari gugus gula didekatnya. Jadi satu pita dari spiral ganda mempunyai arah dari 5’ ke 3’, sedang pita yang lain arahnya berlawanan yaitu dari 3’ ke 5’. Hal ini disebut polaritas berlawanan.

i.      Endonuklease

Suatu endonukleasi telah diketemukan, yang menyebabkan pitusnya pita ADN sehingga dapat memisah. Kedua pita ADN memisah sebagai persiapan untuk replikasi.

j.     Struktur ADN dan Struktur Kromosom

ADN dapat dibuat in vitro dengan mencampur ADN dari organisme hidup sebagai catakan atau primer) dengan ADN saja (disebut ADN telanjang) dengan ADN polimerase nukleotida A, T, S, G. ADN barumempunyai urutan basa yangsama dengan ADN primer.

Penelitian mengenai replikasi ADN in vitro telah dilakkan dengan menggunakan kromosom prokariote yang hanyya terdiri dari ADN saja (disebut ADN telanjabg). Kromosomini telah diisolasi dan diamati dengan mikroskop elektron. Diameter dari pita kembar tepat untuk spiral ganda dari Watson-Crick yaitu 20-25 A⁰

k.   Sintesis  Protein

Proses sintesis atau pembentukan protein memerlukan adanya molekul RNA yang merupakan materi genetik di dalam kromosom, serta DNA sebagai pembawa sifat keturunan. Gen menspesifikasikan protein melalui transkripsi dan translasi.

l.      Pengaturan Gen Pada Sintesis Protein

Aliran imformasi genetik dari kromosom (asam nukleat) sampai terjadi protein. Ini disebut central dogma diusulkan oleh Crick pada tahun 1958. Dengan kata lain ada urutan informasi dari ADN kepada ARN kemudian protein.

m. Bentuk-bentuk ARN

ARN – duta (Messenger RNA = m RNA) – menerima kode dari ADN dan membawanya ketempat sintesis protein ARN adalah pita tunggal dan panjangnya konstan untuk suatu gen tertentu tetapi berbeda untuk gen-gen yang berlainan.

ARN – Pemindah (Transfer RNA = t RNA) – terdapat dalam beberapa bentuk, masing-masing khusus untuk asam amino tertentu. Setiap macam ARN – pemidah di bentuk pada satu tempat tertentu pada kromosom, yaitu satu gen tertentu menghasilkan molekul ARN tertentu. ARN – Ribosom (Ribosomal RNA =  r RNA) – mem-bentuk bagian dari ribosom. ARN – ribosom dibuat pada lokasi tertentu pada kromosom yakni daerah nukleolus (nucleolar organizing region).

n.   Transkripsi

1.    Pembentukan ARN pada ADN cetakan 

Spiral ADN memisah tetapi hanya satu pita yang digunakan transkripsi ARN. Diperlukan suatu ensim ARN polimirase dalam pengaktifan basa-basa dan pemindahannya kepad cetakan ADN untuk transkripsi

2.    Pembebtukan Pita ARN Duta

Satu spiral ganda ADN yang ditranskripsi dapat di gambarkan sebagai berikut (satu bagian pendek dari satu pita).

3.    Translasi

Translasi ini merupakan proses penterjemjemahan urutan nukleotida pada ARN-duta dan menghasilkan urutan asam mino dalam sintetsis protein. Translsi memburuhkan ARN-duta tetapi fungsinya yang tepat tidak diketahui

4.    Translasi memerlukan ARN-pemindah

Molekul ARN-pemindah berbebtuk loop dan memindahkan asam amino dari sitoplasma kepda ribosom. Setiap ARN-pemindah memberikan satu ciri-ciri asam amino tertentu. Satu ujung dari ARN-pemindah yang berbentuk daun klofor / seperti semanggi  (ujung 3’) merupakan tempat menerim asam amino tertentu.

o.      Teknik Molekuler DNA

Sekarang ini penggunaan metode molekuler telah sangat luas untuk analisis sel dan penentuan urutan nukleotida dari keseluruhan genom.  Pengetahuan mengenai aktivitas DNA polymerase, enzim restriksi dan DNA ligase melahirkan teknik-teknik kloning DNA dan PCR (polymerase chain reaction) yang memungkinkan diisolasinya segmen DNA.  Para ilmuwan juga telah mengembangkan alat dan metode untuk memurnikan protein dan meneliti fungsinya.

Isolasi DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata.  Tetapi DNA dapat diekstrak dari ribuan sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang sangat banyak.  Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus dan pengendapan/presipitasi DNA. Ekstraksi DNA memiliki banyak aplikasi praktis, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sitematik, konservasi, dll. Dalam ekstraksi DNA tumbuhan, metode ekstraksi yang sering digunakan adalah berdasarkan Doyle dan Doyle 91989). 

Elektroforesis DNA, Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel.  Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik.  DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif (Gambar 1).  Molekul yang berukuran besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.

Dua alternatif macam gel adalah poliakrilamida dan agarosa.  Poliakrilamida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya beberapa atau bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa).  Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa.

DNA yang berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel agarosa.  DNA yang sangat besar melewati matriks dengan satu ujung bergerak lebih dulu sedang ujung lainnya mengikuti.  Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 kb) bermigrasi dengan jarak yang sama sehingga tidak dapat diamati pemisahannya.  DNA yang sangat panjang ini dapat dipisahkan satu sama lainnya dengan jika daerah listrik diaplikasikan dalam ‘pulses’ yang berasal secara orthogonal satu sama lainnya.  Teknik ini disebut pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).

Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan RNA.  Seperti juga DNA, RNA memiliki muatan negative, tetapi molekul RNA merupakan molekul utas tunggal dan memiliki struktur sekunder atau tersier.  Untuk mengatasinya, RNA diberi perlakuan dengan glyoxal yang bereaksi dengan RNA sehingga menghalangi pembentukan pasangan basa.  RNA yang ter-glyoxylasi tidak dapat membentuk struktur sekunder atau tersier sehingga dapat bermigrasi dengan mobilitas yang proporsional terhadap ukurannya.  Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan protein dengan prinsip yang sama.

Pemotongan DNA dengan enzim restriksi Kebanyakan molekul DNA dalam sel berukuran lebih besar dari yang diperlukan untuk analisa DNA di laboratorium.  Jika akan mempelajari gen secara individual atau mempelajari situs individual pada DNA, molekul DNA berukuran besar di dalam sel harus dipotong ke dalam fragmen-fragmen yang lebih kecil.  Pemotongan DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi.  Nuklease ini adalah enzim yang memotong DNA pada tempat tertentu dengan cara mengenali urutan basa yang spesifik

Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi molekuler umumnya mengenali urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi tertentu yang telah ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut.  Contohnya adalah enzim EcoRI yang ditemukan pada strain Escherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama (I) ditemukan pada spesies ini.  Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′.

Jika molekul DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misalnya oleh HindIII yang mengenali urutan  6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong dengan EcoRI, maka molekul DNA dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda (Gambar 4).  Jadi sebuah molekul akan menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu set enzim restriksi yang berbeda.

Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri Staphylococcus aureus mengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′ sehingga enzim ini memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA, kira-kira satu kali dalam 250bp.  Di sisi lain terdapat enzim retriksi yang mengenali sekuens oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata memotong hanya sekali dalam 65 kb.

Enzim restriksi tidk hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali, tetapi juga pada pada struktur hasil produk pemotongannya.  Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan produk dengan ujung tumpul, enzim lain seperti EcoRI, HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket.

Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik  DNA yang telah terdenaturasi memiliki kapasitas untuk bergabung kembali (untuk membentuk kembali pasngan basa di antara utas komplementer).  Hal ini menyebabkan terjadinya pembentukan molekul hybrid saat homolog, DNA yang terdenaturasi dari dua sumber yang berbeda bercampur satu sama lain dalam kondisi yang sesuai kekuatan ion dan temperaturnya.  Proses perpasangan basa antara polinukleotida utas tunggal yang komplementer disebut hibridisasi.

Banyak teknik yang tergantung pada ke-khas-an hibridisasi antara dua molekul DNA dari sekuens yang komplementer.  Sebagai contoh, hibridisasi merupakan dasar untuk mendeteksi sekuens spesifik dalam campuran asam nukleat yang kompleks.  Dalam hal ini, satu molekul adalah ‘probe’ dari sekuens tertentu (dapat berupa sekuens yang dimurnikan atau molekul DNA yang disintesis secara kimia.  Probe digunakan untuk mencari molekul yang memiliki sekuens komplementer dalam campuran DNA.  DNA probe harus dilabel, sehingga dapat dengan mudah diketahui lokasinya saat telah menemukan sekuens targetnya.    Campuran yang telah ter=probe dipisahkan berdasarkan ukuran pada gel atau didistribusikan sebagai perpustakaan klon (library of clones).

Misalnya genom yeast dipotong dengan enzim EcoRI dan peneliti ingin mengetahui ukuran fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan.  Saat diwarnai dengan etidium bromida, ribuan fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan genom yeast dengan enzim restriksi berjumlah terlalu banyak sehingga tidak dapat dipisahkan menjadi ‘band’ DNA yang terpisah.  Mereka tampak ‘smear’.  Teknik yang dianamakan Southern blot hybridization akan mengidentifikasi ukuran dari fragmen tertentu di antara smear DNA.  Gel edirendam dalam larutan alkamli untuk mendenaturasikan double heliks.  Fragmen ini kemudian ditransfer dari gel ke membrane yang bermuatan positif tempat DNA akan terikat.  Setelah DNA tertransfer pada membran, membran diinkubasi dengan probe yang mengandung sekuens DNA komplementer dengan sekuens yang diinginkan.  ‘Probing’ dilakukan dalam kondisi konsentrasi garam dan temperature dekat dengan kondisi denaturasi dan reanturasi asam nukleat.  Dalam kondisi ini DNA probe akan berhibridisasi dengan kuat hanya dengan komplementer yang tepat.

Media film atau media yang sensitif terhadap cahaya atau elektron yang dikeluarkan oleh DNA yang dilabel dapat mendeteksi lokasi probe berhibridisasi. Saat X-ray film diekspos ke filter dan di-develop, maka akan menghasilkan autoradiogram dengan pola terekspos sama dengan lokasi hybrid.

1.      Kloning DNA

Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA.  Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector.  Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain.  Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.

a.       Kloning DNA dalam plasmid vektor

DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak.  Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteri E. coli.

b.      Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:

a.    Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang  memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.

b.    Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang membawa vector (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi

c.    Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi.  Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector  sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.

c.       Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid.  Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri.  Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.

d.      Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah.  Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI.  Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 7).

B.       Sinteti Protein

Proses sintesis atau pembentukan protein memerlukan adanya molekul RNA yang merupakan materi genetik di dalam kromosom, serta DNA sebagai pembawa sifat keturunan. Gen menspesifikasikan protein melalui transkripsi dan translasi.

          i.               Prinsip-prinsip dasar transkripsi dan translasi

Gen menyediakan instruksi untuk membuat protein spesifik. Akan tetapi, gen tidak membangun protein secara langsung. Jembatan antara DNA dan sintesis protein adalah asam nukleat RNA. RNA mirip dengan DNA secara kimiawi, hanya saja RNA mengandung gula ribosa sebagai pengganti deoksiribosa dan mengandung basa bernitrogen urasil sebagai pengganti timin. Dengan demikian, setiap nukleotida di sepanjang untai DNA mengandung A, G, C, atau T sebagai basanya, sedangkan setiap nukleotida disepanjang untai RNA mengandung A, G, C, atau U sebagai basanya. Molekul RNA biasanya terdiri atas satu untai tunggal.

Dalam RNA atau DNA, monomer adalah keempat tipe nukleotida, yang berbeda dalam kandungan basa benitrogen. Gen umumnya memiliki panjang yang mencapai ratusan atau ribuan nukleotida; masing-masing gen mengandung sekuens basa spesifik. Setiap polipeptida dari suatu protein juga mengandung monomer-monomer yang tertata dalam urutan linear tertentu ( struktur primer protein ), namun monomer-monomernya merupakan asam amino. Dengan demikian, asam nukleat dan protein mengandung informasi yang tertulis dalam dua bahasa kimiawi yang berbeda. Ini membutuhkan dua tahap utama dari DNA ke protein, yaitu transkripsi dan translasi.

a.    Gen dan Protein

1.    Gen adalah urutan nukleotida tertentu dalam kromosom. Urutan nukleotida tersebut berbeda-beda untuk setiap gen dan menentukan urutan asam amino pada protein.

2.    Protein adalah suatu molekul raksasa yang dibentuk dari asan amino yang mengikat satu dengan yang lain oleh ikatan peptida sehingga merupakan rantai panjang. 

3.    Sistron adalah bagian ADN yang memberi kode untuk satu rantai polipeptida. Namanya menunjukkan struktur gen yang lebih halus. Satu gen (sistron) memberi kode untuk satu protein atau ensim bila terbuat dari polipeptida tunggal. Beberapa protein (ensim) mempunyau dua rantau polipeptida. Jadi dua sistron diperlukan untuk memberikan kode.

Proses sintesis atau pembentukan protein memerlukan adanya molekul RNA yang merupakan materi genetik di dalam kromosom, serta DNA sebagai pembawa sifat keturunan. Gen menspesifikasikan protein melalui transkripsi dan translasi.

        ii.          Prinsip-prinsip Dasar Transkripsi dan Translasi

Gen menyediakan instruksi untuk membuat protein spesifik. Akan tetapi, gen tidak membangun protein secara langsung. Jembatan antara DNA dan sintesis protein adalah asam nukleat RNA. RNA mirip dengan DNA secara kimiawi, hanya saja RNA mengandung gula ribosa sebagai pengganti deoksiribosa dan mengandung basa bernitrogen urasil sebagai pengganti timin. Dengan demikian, setiap nukleotida di sepanjang untai DNA mengandung A, G, C, atau T sebagai basanya, sedangkan setiap nukleotida disepanjang untai RNA mengandung A, G, C, atau U sebagai basanya. Molekul RNA biasanya terdiri atas satu untai tunggal.

Dalam RNA atau DNA, monomer adalah keempat tipe nukleotida, yang berbeda dalam kandungan basa benitrogen. Gen umumnya memiliki panjang yang mencapai ratusan atau ribuan nukleotida; masing-masing gen mengandung sekuens basa spesifik. Setiap polipeptida dari suatu protein juga mengandung monomer-monomer yang tertata dalam urutan linear tertentu (struktur primer protein), namun monomer-monomernya merupakan asam amino. Dengan demikian, asam nukleat dan protein mengandung informasi yang tertulis dalam dua bahasa kimiawi yang berbeda. Ini membutuhkan dua tahap utama dari DNA ke protein, yaitu transkripsi dan translasi.

a.    Transkripsi

Transkripsi adalah sintesis RNA dibawah arahan DNA. Kedua asam nukleat menggunakan bahasa yang sama, dan informasi hanya ditranskripsi, atau disalin, dari satu molekul menjadi molekul lain. Selain menjadi cetakan untuk sintesis untai komplementer baru saat replikasi DNA, untai DNA juga bisa berperan sebagai cetakan untuk merakit sekuens nukleotida RNA komplementer. Untuk gen pengode protein, molekul RNA yang dihasilkan merupakan transkrip akurat dari instruksi pembangun protein yang dikandung oleh gen. molekul RNA transkrip bisa dikirimkan dalam banyak salinan. Tipe molekul RNA ini disebut RNA duta (messenger RNA, mRNA) karena mengandung pesan genetik dari DNA ke mekanisme penyintesis protein sel. Transkripsi menghasilkan 3 macam RNA yaitu mRNA, tRNA, dan rRNA. mRNA (messenger RNA) fungsinya membawa informasi DNA dari inti sel ke ribosom. Pesan-pesan ini berupa triplet basa yang ada pada mRNA yang disebut kodon. Kodon pada mRNA merupakan komplemen dari kodogen (agen pengode), yaitu urutan basa-basa nitrogen pada DNA yang dipakai sebagai pola cetakan. Peristiwa pembentukan mRNA oleh DNA di dalam inti sel, disebut transkripsi.

tRNA (RNA transfer) fungsinya mengenali kodon dan menerjemahkan menjadi asam amino di ribosom. Peran tRNA ini dikenal dengan nama translasi (penerjemahan). Urutan basa nitrogen pada tRNA disebut antikodon. Bentuk tRNA seperti daun semanggi dengan 4 ujung yang penting, yaitu: 1) Ujung pengenal kodon yang berupa triplet basa yang disebut antikodon. 2) Ujung perangkai asam amino yang berfungsi mengikat asam amino. 3) Ujung pengenal enzim yang membantu mengikat asam amino. 4) Ujung pengenal ribosom.

rRNA (RNA Ribosom) fungsinya sebagai tempat pembentukan protein. rRNA terdiri dari 2 sub unit, yaitu: 1) Sub unit kecil yang berperan dalam mengikat mRNA. 2) Sub unit besar yang berperan untuk mengikat tRNA yang sesuai.

Transkripsi terjadi di dalam sitoplasma dan diawali dengan membukanya rantai ganda DNA melalui kerja enzim RNA polimerase. Sebuah rantai tunggal berfungsi sebagai rantai cetakan atau rantai sense, rantai yang lain dari pasangan DNA ini disebut rantai anti sense. Tidak seperti halnya pada replikasi yang terjadi pada semua DNA, transkripsi ini hanya terjadi pada segmen DNA yang mengandung kelompok gen tertentu saja. Oleh karena itu, nukleotida nukleotida pada rantai sense yang akan ditranskripsi menjadi molekul RNA dikenal sebagai unit transkripsi.

Transkripsi meliputi 3 tahapan, yaitu tahapan inisiasi, elongasi, dan terminasi.

1.         Inisiasi (Permulaan)

Proses replikasi dikenal daerah pangkal replikasi, pada transkripsi ini dikenal promoter, yaitu daerah DNA sebagai tempat melekatnya RNA polimerase untuk memulai transkripsi. RNA polymerase melekat atau berikatan dengan promoter, setelah promoter berikatan dengan kumpulan protein yang disebut faktor transkripsi. Kumpulan antara promoter, RNA polimerase, dan faktor transkripsi ini disebut kompleks inisiasi transkripsi. Selanjutnya, RNA polymerase membuka rantai ganda DNA.

2.         Elongasi (Pemanjangan)

Setelah membuka pilinan rantai ganda DNA, RNA polimerase ini kemudian menyusun untaian nukleotida-nukleotida RNA dengan arah 5´ ke 3´. Pada tahap elongasi ini, RNA mengalami pertumbuhan memanjang seiring dengan pembentukan pasangan basa nitrogen DNA. Pembentukan RNA analog dengan pembentukan pasangan basa nitrogen pada replikasi. Pada RNA tidak terdapat basa pirimidin timin (T), melainkan urasil (U). Oleh karena itu, RNA akan membentuk pasangan basa urasil dengan adenin pada rantai DNA. Tiga macam basa yang lain, yaitu adenin, guanin, dan sitosin dari DNA akan berpasangan dengan basa komplemennya masing-masing sesuai dengan pengaturan pemasangan basa. Adenin berpasangan dengan urasil dan guanin dengan sitosin

3.         Terminasi (Pengakhiran)

Penyusunan untaian nukleotida RNA yang telah dimulai dari daerah promoter berakhir di daerah terminator. Setelah transkripsi selesai, rantai DNA menyatu kembali seperti semula dan RNA polymerase segera terlepas dari DNA. Akhirnya, RNA terlepas dan terbentuklah mRNA yang baru. Pada sel prokariotik, RNA hasil transkripsi dari DNA, langsung berperan sebagai mRNA. Sementara itu, RNA hasil transkripsi gen pengkode protein pada sel eukariotik, akan menjadi mRNA yang fungsional (aktif) setelah melalui proses tertentu terlebih dahulu. Dengan demikian, pada rantai tunggal mRNA terdapat beberapa urut-urutan basa nitrogen yang merupakan komplemen (pasangan) dari pesan genetik (urutan basa nitrogen) DNA. Setiap tiga macam urutan basa nitrogen pada nukleotida mRNA hasil transkripsi ini disebut sebagai triplet atau kodon.

b.    Translasi

Translasi adalah sintesis polipeptida yang terjadi dibawah arahan mRNA. Selama tahap ini terjadi perubahan bahasa. Sel harus menerjemahkan alias menstranslasikan sekuens basa molekul mRNA menjadi sekuens asam amino polipeptida. Tempat terjadinya translasi adalah ribosom, partikel-partikel kompleks yang memfasilitasi penautan teratur asam amino menjadi rantai polipetida. Translasi merupakan proses penerjemahan beberapa triplet atau kodon dari mRNA menjadi asam amino-asam amino yang akhirnya membentuk protein. Urutan basa nitrogen yang berbeda pada setiap triplet, akan diterjemahkan menjadi asam amino yang berbeda.

Misalnya, asam amino fenilalanin diterjemahkan dari triplet UUU (terdiri dari 3 basa urasil), asam amino triptofan (UGG), asam amino glisin (GGC), dan asam amino serin UCA. Sebanyak 20 macam asam amino yang diperlukan untuk pembentukan protein merupakan hasil terjemahan triplet dari mRNA. Selanjutnya, dari beberapa asam amino (puluhan, ratusan, atau ribuan) tersebut dihasilkan rantai polipeptida spesifik dan akan membentuk protein spesifik pula.

Langkah-langkah pada proses translasi adalah sebagai berikut:

a.         Inisiasi Translasi

Ribosom sub unit kecil mengikatkan diri pada mRNA yang telah membawa sandi bagi asam amino yang akan dibuat, serta mengikat pada bagian inisiator tRNA. Selanjutnya, molekul besar ribosom juga ikut  terikat bersama ketiga molekul tersebut membentuk kompleks inisiasi. Molekul-molekul tRNA mengikat dan memindahkan asam amino dari sitoplasma menuju ribosom dengan menggunakan energi GTP dan enzim. Bagian ujung tRNA yang satu membawa antikodon, berupa triplet basa nitrogen. Sementara, ujung yang lain membawa satu jenis asam amino dari sitoplasma. Kemudian, asam amino tertentu tersebut diaktifkan oleh tRNA tertentu pula dengan menghubungkan antikodon dan kodon (pengode asam amino) pada mRNA. Kodon pemula pada proses translasi adalah AUG, yang akan mengkode pembentukan asam amino metionin. Oleh karena itu, antikodon tRNA yang akan berpasangan dengan kodon pemula adalah UAC. tRNA tersebut membawa asam amino metionin pada sisi pembawa asam aminonya.

b.         Elongasi

Tahap pengaktifan asam amino terjadi kodon demi kodon sehingga dihasilkan asam amino satu demi satu. Asam-asam amino yang telah diaktifkan oleh kerja tRNA sebelumnya, dihubungkan melalui ikatan peptida membentuk polipeptida pada ujung tRNA pembawa asam amino. Misalnya, tRNA membawa asam amino fenilalanin, maka anticodon berupa AAA kemudian berhubungan dengan kodon mRNA UUU. Fenilalanin tersebut dihubungkan dengan metionin membentuk peptida. Melalui proses elongasi, rantai polipeptida yang sedang tumbuh tersebut semakin panjang akibat penambahan asam amino.

c.         Terminasi

Proses translasi berhenti setelah antikodon yang dibawa tRNA bertemu dengan kodon UAA, UAG, atau UGA. Dengan demikian, rantai polipeptida yang telah terbentuk akan dilepaskan dari ribosom dan diolah membentuk protein fungsional.

Perbedaan Proses Transkripsi Dan Translasi Pada Prokariotik Dan Eukariotik

Mekanisme dasar transkripsi dan translasi mirip pada prokariotik dan eukariotik, namun ada perbedaan penting dalam aliran informasi genetik pada sel-sel. Karena sel prokariotik tidak memiliki nukleus, DNAnya tidak disegregasi dari ribosom dan peralatan penyintesis protein lain. Ketiadaan segregasi ini memungkinkan translasi mRNA dimulai saat transkripsi masih berlangsung. Sebaliknya, dalam sel eukariotik, selaput nukleus memisahkan tempat dan waktu berlangsungnya transkripsi dan translasi. Transkripsi terjadi di dalam nukleus, dan mRNA ditranspor ke sitoplasma, tempat translasi terjadi.

Namun sebelum bisa meninggalkan nukleus, transkrip RNA eukariotik dari gen pengode protein dimodifikasi dalam berbagai cara untuk menghasilkan mRNA akhir yang fungsional. Transkripsi gen eukariotik pengode protein menghasilkan pre-mRNA, dan pemrosesan lebih lanjut menghasilkan mRNA akhir. Awal transkrip RNA dari gen apapun, termasuk yang mengodekan RNA yang tidak ditranslasi menjadi protein, secara umum disebut transkrip primer ( primary transcript ).

C.      Kode Genetik

Hubungan antara urutan nukleotida pada ARN-pemindah (seperti yang ditentukan oleh ADN) dan urutan asam amino pada molekul protein. Kode genetik menentukan transformasi dari suatu urutan nukleotida menjadi urutan asam amino.

1.    Kode Triplet

Kode genetik terdiri dari tiga pasang nukleotida yang berurutan atau satu triplet. Ini merukan kode yang mubasir (kelebihan) karena satu asam amino tertentu ditentukan lebih dari satu (triplet) penelitian-penelitian menunjukkan empat macam basa A, T,  G, S, dengan kombinasi yang terdiri dari tiga basa dapat memberi kode dupuluh macam asam amino utama.

2.    Kode Genetik

a.    Kromosom

b.    Reproduksi Sel

c.    Penentuan Jenis kelamin